上期向大家分享了出现扩增曲线本底不断升高和分子信标做的阴性对照，曲线为一条斜线，是什么原因？本期我们继续深入了解荧光定量PCR实验相关的知识。

由于ABI仪器采用半导体加热，其边缘效应致使96孔加热模块的中央温度高，周边温度低。

由于定量原理是通过已知浓度的标准品和未知样本之间的比较来进行的，所以各孔位的反应参数可比性决定了定量的准确性。

在模板浓度低的时候ABI的仪器各孔位热循环不均导致的误差经过多个循环后被放大，最终影响定量结果的准确性。所以ABI仪器只能区分5000个拷贝和10000个拷贝的差异，而且必须用ABI的原装试剂才能达到此效果，如果将模板再稀释，就无法区分这2倍浓度差异了。

实验加入起的始模板数分别是1000、100、10copy/ul 的反应孔，模板浓度太低了，ABI7000仪器不能检测出来，建议用高浓度模板来做标准曲线。

虽然现在的定量PCR仪好多都宣称能做到单拷贝检测，但这个前提是非常苛刻的。需要模板、引物、体系、实验条件设置一切都是最优的情况下才可能做出来，而且一般还有比例。像一般低拷贝检测Ct值不准确的情况还是很正常的。一般临床检测的下限不会低于100拷贝，所以要考虑是不是真的要做低拷贝的检测。另外，当Ct值大于30的时候结果就存在很大的不可信性，要反复确认，而低拷贝的Ct值一般都会大于30。

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