上期我们分享了real time PCR相关的三个问题，本期我们继续深入了解荧光定量PCR实验相关的知识。

定量PCR中，质粒作为标准分子为何要线性化？

因为要检测的目的基因如果不出意外的话，应该是线性的，而用来定标准曲线的目的基因确是连接在环状的质粒上的。单从变性和复性的难易上就会有很大的区别，当然会对引物的结合等各方面造成影响，何况环状的空间构象和线性的空间构象上的差异了。

做标准曲线时的基本原则之一就是要尽量的模仿需要定量的基因所在的自然条件，所以说，如果做标准曲线时可以有条件做到用和要检测的基因一样的标准品做标准曲线的话，就不要选择把一段基因克隆到质粒上。

但是一般情况下是很难做到的。

有人说没有酶切效果还行，那只是还行。

如果做标准曲线或者相对定量，建议阈值还是一样比较好。

荧光定量本来就是很容易受到很多因素影响的实验，当然是要求严点好了，当然如果要检测的基因本身就是环状的，那当然不用线性化了，那样反而不好了。

线性化比较麻烦：首先要酶切，保证完全酶切，才能全部线性化。然后要回收，质粒酶切后再回收容易被破坏，而且回收率也不是很高。第三，相对于环状质粒来说，线性化的质粒不容易保存。

所以，如果有实验证据证明不线性化的质粒可以用，那就可以省去很多事情了。

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