在上期我们分享了最佳荧光采集温度和荧光定量PCR检测灵敏度和线性范围的关系。本期我们继续深入了解荧光定量PCR实验相关的知识。

一、real time PCR CT值一般在多少后认为模板没扩增？

当进入对数期的循环数大于35个时，RealTime RT-PCR检测无效，基因没有表达；当进入对数的循环数在32-35个循环时，需要有至少3个重复才能判断是否能检测到基因的表达。

二、real time PCR无结果，而用产物跑电泳条带很清楚，是什么问题？

发生这样的情况是因为加样的时间太长了，荧光染料暴露时间太长了，荧光基团淬灭了，出现上述问题还有一种情况，那就是荧光PCR仪的荧光采取信号值太低，有时也不稳定。

如果使用探针法，有荧光信号而没有求出Ct值，那么可能是探针浓度有问题，可能太高或者太低了，可能改变探针浓度看看。

三、real time PCR不同基因之间的阈值(threshold)是不是要一样?

如果做标准曲线或者相对定量，建议阈值还是一样比较好。

而且阈值一般要放置于扩增曲线的指数段，即荧光数据对数坐标轴下的线性段。如果扩增曲线的效率接近，阈值线的位置对于定量结果的影响是微乎其微的。

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