在上期我们了解了关于荧光定量污染解决办法和real-time PCR重复性问题。本期我们继续深入了解荧光定量PCR实验相关的知识。

一、******荧光采集温度？

采集荧光的时机不是决定于温度，而是决定于采用的方法。

如果采用染料法，一般要在延伸阶段的末点进行检测，而72度延伸的效率最高，所以采用染料法时大多在72度检测。如果扩增产物中存在引物二聚体，也有采用更高的读板温度，比如76度、80度等，这时的读板温度与引物二聚体的Tm值相关。

如果采用TaqMan探针法，由于TaqMan探针是累积荧光，理论上说在任何步骤检测都可以，但目前TaqMan大多采用两步法，所以在退火的末点进行检测即可。 如果采用分子信标的方法，就要在退火的末点进行检测。 如果采用FRET探针法，要在退火时进行荧光检测。

二、荧光定量PCR检测灵敏度和线性范围的关系

一般大家认为的检测灵敏度即检测下限，可以理解为能检测到和准确定量的最低浓度(拷贝数)，而线性范围为能够检测的区间，即可以检测及分辨的最低浓度到最高浓度的数量级，但两者都与荧光定量PCR仪器及试剂体系相关。

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