上期我们为大家分享了“荧光定量PCR的SG和CT值的问题”，本期我们继续来挖掘实验中的出现的异常问题。

一、荧光定量污染解决办法

1. 配反应体系和加模板要在不同的屋子进行；

2. 配体系的屋子准备一件干净的白大衣，要注意的是每次进去都要记得换白大衣，至少要把别的屋子穿的白大衣脱掉；

3. 分装好体系以后把反应板/条放在一个有盖的干净的托盘中端到加样的房间；

4. 配体系戴的手套可以带到加样的房间，反过来不可；

5. PCR完毕后，反应产物拿到别的屋子扔掉；

6. 最重要的就是不要把DNA带到配体系的屋子，以上几点也都是为了这一目的。

图1-1（扩增效率偏高）

上图中标准曲线最低浓度点被外源DNA污染，导致提前扩增，扩增效率偏高。

图1-2（精密度不合格）

上图中标准曲线扩增正常，线性相关系数R=1，扩增效率Eff%=98.67，说明实验操作无问题，但孔间精密度偏差较大，为DNA气溶胶污染。

图1-3（实验专属不合格）

上图中标曲线性相关系数（R≥0.99）及扩增效率（90-105%）均符合要求，但阴性扩增CT值＜35，实验专属性不合格。

二、荧光定量real-time PCR重复性问题

建议不要只加1ul，而是稀释10倍左右然后加10ul，这样有助于改善重复性。 如果测的是拷贝数，重复性不好是很难避免的，用SYBR green作real time的误差还是比较大的，它的优势在于灵敏度高，但如果想精确定量，还是比较困难的，只好重复很多次，或者多花钱买标记的引物，那个特异性最好。