上期我们为大家分享了“荧光定量PCR熔解曲线高矮和不扩增的问题”，本期我们继续来挖掘实验中的出现的异常问题。     

1、SG的稳定性如何？

只要不进行稀释，SG是非常稳定的。一旦稀释，可以保存1周到3个月，这取决于冻融次数，推荐配置成一定浓度的贮存液，用时现用现配稀释液。

为优化SG反应，有必要在所有的常规步骤来确定，优化扩增反应的条件（合适的MgCl₂、dNTP和Taq酶浓度等）。结果应该在凝胶电泳上有唯一的条带。

SG分析的优化主要包括以下4个因素：

1）SG 浓度

2）引物浓度

3）MgCl₂浓度 

4) 温度和反应次数

推荐的SG终浓度变动范围是1：5000到1：100000。经常用到的浓度范围是1：10000到1：70000。引物浓度的优化应该测试不同浓度的正向和反向引物。引物浓度的范围应该是50nM到300nM，但也有例外的情况。

2、正常情况NTC是不应该出现CT值的吗？

如果是探针法

应该没有Ct值，所谓的没有，也是针对不同算法而言的。NTC一般没有明显的指数扩增，所以一般软件不计算Ct。

如果是染料法

可能在30个循环后有微弱起峰，并且软件计算出Ct值，这时还要观察熔解曲线，看扩增产物是否是引物二聚体。大多情况是二聚体，这时也可以优化条件，比如提高退火温度等。

如果是探针法

阴性对照起峰肯定是污染，如果是染料法，还要看熔解曲线：如果熔解曲线的Tm值在80度以下，那么很可能是引物二聚体；如果熔解曲线是双峰或更多峰，其中有与加模板后的扩增产物的Tm值相同的峰，那么就意味着存在污染。

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