菌种鉴定是指从形态特征、理化特性、遗传进化角度等阐明微生物种群之间的分类学关系。在做菌种鉴定之前，不仅需要通过分离技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还需要确定待鉴定的菌种是不是纯种，常用的纯化方法包括平板划线法和稀释涂布平板法。

一、平板划线法

平板划线法是最简单的微生物分离方法，即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，若划线适宜，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。

优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离。

缺点：不能计数，一般用于从菌种的分离纯化。

二、稀释涂布平板法

将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。

优点：可计数，可观察菌落特征。

缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。

一、常规鉴定

形态特征和理化特性属于常规鉴定的内容。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。

二、BIOLOG自动鉴定

BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。该系统已获美国FDA认可，能鉴定超过2900种常见的好氧细菌、厌氧菌、酵母和丝状真菌等微生物，几乎覆盖了所有重要的与人类、动物、植物相关的微生物。已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。

三、分子生物学鉴定

应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。

四、API细菌鉴定

API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。

其中分子生物学鉴定是菌种鉴定最常用的方法。目前，菌种鉴定技术中分辨率最高、结果最为可靠的是——DNA测序技术。16S rDNA是细菌的系统分类研究中最常用的和最适合的分子钟，在结构与功能上具有高度的保守性，大小约1500 bp，可体现不同菌属之间的差异；18S rDNA是编码真核生物18SrRNA的DNA序列，序列中既有保守区（反映物种间的亲缘关系）又有可变区（体现物种间的差异）。真菌的ITS（Internal Transcribed Space）包括ITS1及ITS2两部分，进化速度快，具有多态性，适于对亲缘关系较近的菌株进行区分鉴定。他们主要原理都是通过比较同源基因/序列的差异来进行菌种鉴定，菌种鉴定具体流程如下：

1. 菌种鉴定的送样要求

如果样品为基因组DNA：DNA浓度>50ng/ul，总体积≥10ul，且无明显降解；

如果样品为菌液和平板：菌液>2ml，有明显菌体，不能过于澄清；平板菌落形态正常，菌落明显、无卫星菌落。

*不接受带致病性的菌体

2. 菌种鉴定可以鉴定到种吗？

16s rRNA作为菌种鉴定相似度超过99%一般定义为同一种菌。若是Sanger测序获得16s全长的都可以鉴定到种，甚至能区分亚种。有些细菌并不只有1个16s序列，会包含有1-15拷贝的16s序列，所以单一的16s序列鉴定可能会出现偏差。利用高通量如454或Miseq测序一般由于读长的缘故，通常只有300-500多个碱基被测序，所以在物种鉴定上一般比较可靠的是能分类到属，部分能分类到种。

3. 微生物的菌种鉴定可以鉴定到“株”一级吗？

若菌株是从自然界中分离得到的，那就只能鉴定到种，不能鉴定到株，因为多多少少和其他株系的细菌有区别，即便做了一些特征的鉴定，发现和某一株细菌一模一样，也没有理由说细菌就是那一株细菌，因为你不可能把所有的特征都做完，株和株之间的关系就相当于不同的人之间的关系，世界上不可能有完全相同的两个人。除非你知道你的细菌本来就是某一株细菌扩增出来的（而且要保证没有变异，否则就是一个新株），可是这样就没必要鉴定了。

4. PCR扩增切胶纯化测序出现套峰是什么情况？

测序结果个别碱基出现N，或者部分连续出现套峰，是由菌种rDNA多态性造成，对菌种鉴定无影响；所有测序反应均出现大面积套峰，由于客户提供样品模板不纯造成，这种情况需要客户重新纯化菌种或进行TA克隆。

5. 菌种长时间保存后复苏，如何鉴定有没有改变？

仔细观察单菌落的形态结构，比较该单菌落与目的菌单菌落的外在特征，或者查找目的菌特有的生理生化特性，比较现有菌，一般可作出判断；若不能轻易判断，建议对菌株的16sRNA的基因序列进行测序，测序结果与数据库中数据进行比对，构建系统发育树，这样可精确判断菌株是否发生改变。

6. 菌种鉴定的交付内容

样本测序结果、序列拼接文件、PCR产物电泳图和 blast比对鉴定结果，部分结果见下图。

生理生化鉴定：根据微生物对各种生理条件（温度、pH、氧气、渗透压）、生化指标（唯一碳氮源、抗生素、酶、盐碱性）代谢反应进行分析，并将结果转化成软件可以识别的数据，进行聚类分析，与已知的参比菌株数据库进行比较，最终对未知菌进行鉴定的一种技术。

革兰氏染色：系细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。

氧化酶试验：氧化酶不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应而进行的试验，用于区分不发酵的革兰阴性杆菌（氧化酶阳性）和肠道菌（氧化酶阴性）。

触酶试验：大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌属阴性，故常用此试验来鉴定，用于区分葡萄球菌(过氧化氢酶阳性）和链球菌(过氧化氢酶阴性）。

凝固酶试验：用于区分凝固酶阴性葡萄球菌（可推测为非致病性）和凝固酶阳性葡萄球菌(很可能为致病性）。

菌种鉴定（DNA测序技术）一般就是提取基因组DNA、特定引物PCR扩增、PCR产物纯化、上机测序、上GeneBank或者Eztaxon比对和进化树分析。一般序列相似度在99%以上就可以认为是同一种细菌（当然也有例外，DNA序列仅仅是一个参考指标）。

华博基因提供包括基因编辑和分子标记辅助育种、基因组测序、基因定位克隆、蛋白互作、代谢组分析，基因组数据挖掘等技术服务，以及土壤、水分和种子等检测服务。

同时为客户提供全流程动植物分子育种系统解决方案，欢迎大家来电咨询！

0531-86095877 /  0531-82804465

部分案例—甘肃省通渭县“山楂小镇”；

部分尊贵客户

部分企业资质荣誉

实验室一角—承接国内动植物学实验